病原微生物等生物污染是影响土壤和水等农产品产地环境质量的重要因素，进而危害生态安全、农产品质量和人类健康^[1]。发展高效的病原微生物灭活技术对农产品产地环境微生物污染控制具有重要意义。目前使用较多的杀菌技术包括加氯、臭氧和紫外消毒等，但传统技术存在稳定性和持续性不高、易产生三卤甲烷、卤乙酸、溴酸盐等致癌消毒副产物，应用于土壤等介质时作业难度大、成本较高等难题^[2-4]。因此，亟需针对农产品产地环境的应用场景特点发展高效的新型杀菌方法。

开发新型杀菌材料是发展杀菌方法和技术的重要方向。材料与细菌的有效接触面积是影响消毒效率的重要因素，多孔材料比表面积大的特点为开发高效杀菌材料提供了基础，但比表面积大的多孔材料的有效孔径尺寸主要集中在微孔(< 2 nm)和中孔(2~50 nm)；常见的大肠杆菌等细菌的尺寸多在微米级，即使大孔(>50 nm)的内表面也难以与细菌有效接触，存在大量的无效面积。因此，研制具有与细菌尺寸相匹配的微米级超大孔结构的杀菌材料可以大幅提高材料的消毒效能。目前，构建超大孔材料用于消毒的研究非常有限，SANG等^[5]采用原位自由基聚合法构建了带正电荷的微米级大孔纳米酶-水凝胶，利用水凝胶的超大孔结构可有效捕获细菌，与传统纳米酶相比可以更好地提高活性氧抗菌效率。另有文献报道了以微生物载体为开发目的的具有微米级超大孔结构的材料，如DONG等^[6]以机械压缩为调控手段，将竹材废料粉碎筛分后，按照不同压缩比压块造粒，炭化后经水蒸气等活化剂活化，制备了一种新型超大孔活性炭，其中大孔孔径范围为0.1~100 μm，增加了适合细菌附着的表面，与常规商用微孔活性炭相比，提高了生物活性炭(BAC)工艺在低温下污染物的去除率；YOU等^[7]针对微生物燃料电池中传统碳布阳极附着细菌数量有限、产电效率低的问题，利用三聚氰胺海绵热解形成石墨碳海绵，构建了具有三维大孔结构的石墨碳海绵阳极，提高了产电菌附着量，增强了阳极与产电菌的胞外电子传递效率。但这些超大孔材料成本较高、制备工艺复杂，仍需开发低成本的微米级超大孔杀菌材料。

生物炭是一种制备工艺简单、价格低廉、环境友好的多孔材料^[8-10]。采用废弃生物质制备生物炭可推动农业废弃物资源化利用，符合可持续发展的理念。然而，常见生物炭(如椰壳炭、果壳炭等)的孔隙中微孔(< 2 nm)占总孔数的90%以上，比表面积90%以上由微孔提供。因此，常见生物炭和病原微生物的有效接触有限，且其本身不能杀灭病菌。可对生物炭的孔结构进行合理设计和构筑以提高生物炭的杀菌消毒能力。该研究受海绵泡沫开放型超大孔材料结构特点的启发，利用含海绵体的生物质(如柚子皮)天然具有微米级超大孔结构的特点^[11]，基于该类生物质在炭化后仍可保留超大孔特性，开发了超大孔海绵体生物炭(柚子皮生物炭)杀菌技术。通过探究超大孔海绵体生物炭灭活大肠杆菌(Escherichia coli)的影响因素及微米级超大孔结构的关键作用，可为农产品产地环境生物污染削减和阻控提供新方法和新思路。

1.   材料与方法

1.1   超大孔海绵体生物炭制备与表征

选取柚子皮洗净、切割成5 mm左右的颗粒；将颗粒状柚子皮采用烘箱烘干，烘箱温度设定为60 ℃，烘干时间为12 h；烘干的柚子皮颗粒采用管式炉在氮气保护下进行高温炭化(10 ℃·min^-1升温到600 ℃，保温2 h后自然降温)，冷却后获得柚子皮生物炭。对比实验中椰壳生物炭制备则将原料替换为椰壳，其他处理步骤与柚子皮生物炭相同。采用扫描电镜(SEM，Zeiss Gemini 300，德国)表征生物炭的表面形貌。采用BET法通过比表面积和孔隙率分析仪(Micromeritics ASAP2020)测定生物炭的比表面积及微孔-介孔-大孔孔径分布，采用压汞法(Micromeritics Autopore 9500)测定生物炭的超大孔孔径分布^[12]。

1.2   大肠杆菌菌悬液制备

用LB培养基(每升水中含10 g NaCl、10 g胰蛋白胨和5 g酵母粉)在37 ℃、200 r·min^-1下培养大肠杆菌E. coli ATCC 15597，13 h到达稳定期前期。4 ℃、6 000 r·min^-1下离心6 min(离心半径为9.5 cm)，用超纯水洗涤3次洗去培养基，并用超纯水重悬得到细胞浓度为2.5 ×10⁹ CFU·mL^-1的浓缩菌悬液备用。

1.3   消毒实验

将细胞浓度为2.5 ×10⁹ CFU·mL^-1的菌悬液稀释到250 mL的盐溶液(Na₂SO₄或NaCl)中，得到初始浓度为10⁷ CFU·mL^-1的细胞悬浮液。消毒实验开始前将菌液用磁力搅拌器搅拌20 min使之均匀，并在消毒过程中持续搅拌。加入生物炭开始消毒反应，在不同时间点取样，用平板涂布法记录可存活繁殖的细胞数目，采用细菌对数值表示细菌的存活情况^[13]。

柚子皮生物炭体系指加入柚子皮生物炭，盐溶液为Na₂SO₄；柚子皮体系指加入干柚子皮，溶液为纯水或Na₂SO₄；椰壳生物炭体系指加入椰壳生物炭，溶液为纯水或Na₂SO₄；无硫酸盐体系指加入柚子皮生物炭，溶液为纯水；氯盐体系指加入柚子皮生物炭，盐溶液为与Na₂SO₄等离子强度的NaCl；滤液体系指将柚子皮生物炭和Na₂SO₄溶液混合搅拌，2 h后将液体过滤，将滤液与大肠杆菌菌悬液混合，考察滤液的杀菌能力。

1.4   统计分析

采用Origin 2018软件进行数据分析与绘图，采用SPSS Statistics 26软件进行单因素方差分析，分析组间的显著性差异(P < 0.05)。

2.   结果与讨论

2.1   柚子皮生物炭表征

制备的柚子皮生物炭孔径分布及扫描电镜图如图 1~2所示，该方法所制备的柚子皮生物炭为黑色多孔颗粒。柚子皮生物炭内部具有丰富的孔隙结构，孔结构规则，排列整齐，多为微米级超大孔孔道，孔径约为50~200 μm。经BET法测得的微孔-介孔-大孔孔径分布比表面积为3.40 m²·g^-1，孔容为0.004 7 cm³·g^-1，平均孔径为5.56 nm，说明柚子皮生物炭微孔-介孔数量少，因而BET比表面积和孔容小^[14]。

图  1  柚子皮生物炭微孔、介孔、大孔和超大孔孔径分布

Figure  1.  Micropore, mesoporous and macropore and ultra-macroporous size distribution of pomelo peel biochar

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图  2  柚子皮生物炭SEM图

Figure  2.  SEM images of pomelo peel biochar

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而从压汞法测得的超大孔孔径分布可知，柚子皮生物炭的孔径主要集中在40 nm~60 μm，总孔容为5.07 cm³·g^-1，说明柚子皮生物炭微米级超大孔结构丰富，这与扫描电镜结果和文献报道^[15]一致。

2.2   体系条件对柚子皮生物炭消毒效果的影响

2.2.1   柚子皮生物炭投加量对消毒效果的影响

图 3为不同柚子皮生物炭投加量下细菌的灭活情况。在50 mmol·L^-1 Na₂SO₄溶液中(柚子皮生物炭投加量为0 g·L^-1)细菌未失活；随着柚子皮生物炭投加量增大，细菌灭活速率加快。当柚子皮生物炭投加量为1 g·L^-1时，在1 g·L^-1柚子皮生物炭和50 mmol·L^-1的Na₂SO₄溶液作用下，反应1 h细菌失活73.00%, 2 h失活90.88%。当柚子皮生物炭投加量增加到4 g·L^-1时大肠杆菌快速失活，1 h失活99.81%，2 h失活99.97%。

图  3  柚子皮生物炭投加量及硫酸盐浓度对大肠杆菌消毒效果的影响

D为细胞密度。

Figure  3.  Effect of pomelo peel biochar dosage and sulfate concentration on E.coli disinfection

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2.2.2   硫酸盐浓度对柚子皮生物炭消毒效果的影响

图 3为不同硫酸盐浓度下(柚子皮生物炭投加量均为4 g·L^-1)细菌的灭活情况。结果表明，硫酸盐浓度增加，细菌灭活率随之提高。当硫酸盐浓度为0、10、50 mmol·L^-1时，作用1 h时细菌灭活率分别为52.14%、66.12%、99.81%；作用2 h时细菌灭活率分别为68.38%、76.56%、99.97%。

由此可见，在柚子皮生物炭投加量为4 g·L^-1、硫酸盐浓度为50 mmol·L^-1的体系中即可实现细菌的快速灭活。因农产品产地土壤或水环境中本身存在硫酸盐，可根据硫酸盐本底含量控制投加的硫酸盐浓度。超大孔海绵体生物炭杀菌技术中柚子皮生物炭材料成本低廉、制备简单，且该生物炭为颗粒状固体，易于回收，所使用的硫酸盐为常用盐类，无毒无害，且制备过程整体操作方便，无二次污染，无需额外的能量输入，具有较好的应用潜力。

2.3   柚子皮生物炭体系消毒机理探究

2.3.1   柚子皮生物炭体系中生物炭的作用

为探究柚子皮生物炭体系的消毒机理，首先对比了柚子皮生物炭体系与柚子皮体系的杀菌效果。干颗粒状柚子皮和柚子皮生物炭投加量均为4 g·L^-1。如图 4所示，直接用柚子皮与大肠杆菌悬浊液接触对细菌无杀菌作用，即使在柚子皮体系中加入Na₂SO₄溶液也基本无杀菌作用。

图  4  柚子皮生物炭杀菌体系与柚子皮体系的杀菌效果对照

D为细胞密度。同一组直方柱上方英文小写字母不同表示不同处理组之间细胞密度差异显著(P < 0.05)。

Figure  4.  Bactericidal effect comparison between pomelo peel biochar system and pomelo peel system

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而柚子皮生物炭体系中，在柚子皮生物炭和50 mmol·L^-1的Na₂SO₄溶液作用下大肠杆菌快速失活，1 h失活99.81%，2 h失活99.97%。由此可见，超大孔海绵体生物炭杀菌技术中生物炭发挥了重要作用。

2.3.2   柚子皮生物炭超大孔结构的作用

上述结果揭示了在超大孔海绵体生物炭杀菌技术中生物炭的重要性，为了明确一般类型生物炭是否可以取得同样的杀菌效果，笔者进行了柚子皮生物炭体系与椰壳生物炭体系的杀菌效果对比。由图 5可知，无论是在大肠杆菌悬浊液中投加椰壳生物炭还是椰壳生物炭加Na₂SO₄溶液，对细菌均无杀菌作用，此结果与文献[16]报道一致。

图  5  柚子皮生物炭杀菌体系与椰壳生物炭体系的杀菌效果对照

D为细胞密度。同一组直方柱上方英文小写字母不同表示不同处理组之间细胞密度差异显著(P < 0.05)。

Figure  5.  Bactericidal effect comparison between pomelo peel biochar system and coconut shell biochar system

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而柚子皮生物炭体系中，在柚子皮生物炭和50 mmol·L^-1的Na₂SO₄溶液作用下，大肠杆菌快速失活，1 h失活99.81%，2 h失活99.97%。因此，柚子皮生物炭的超大孔结构在杀菌过程中发挥了不可替代的作用。

进一步对比柚子皮生物炭和椰壳生物炭的大孔孔径分布(图 6)，柚子皮生物炭孔径主要集中在直径40 nm~60 μm，总孔容为5.07 cm³·g^-1；而椰壳生物炭在大孔范围的孔隙极不发达，主要孔隙在 < 2 nm的微孔范围内，总孔容为0.195 cm³·g^-1。结合柚子皮生物炭孔径分布和扫描电镜结果进行分析，推断柚子皮生物炭的微米级超大孔结构与细菌尺寸相适配，能较好地捕集细菌或将捕集的细菌接触式灭活^[17-18]。

图  6  柚子皮生物炭和椰壳生物炭的孔径分布对照

Figure  6.  Pore size distribution of pomelo peel biochar and coconut shell biochar

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2.3.3   柚子皮生物炭体系中硫酸盐的作用

从上述影响因素研究结果可知，在超大孔海绵体生物炭杀菌技术中除了超大孔海绵体生物炭的作用外，硫酸盐也是一大影响因素，因此笔者对比了柚子皮生物炭体系与无硫酸盐体系的杀菌效果。由图 7可见，在无硫酸盐的体系中，当柚子皮生物炭(投加量为4 g·L^-1)与大肠杆菌悬浊液接触时也有一定的杀菌效果，1 h失活52.14%，2 h失活76.56%，但与添加了硫酸盐的柚子皮生物炭杀菌体系相比，大肠杆菌灭活速率明显偏慢。在柚子皮生物炭杀菌体系中柚子皮生物炭和50 mmol·L^-1的Na₂SO₄溶液作用下，大肠杆菌快速失活，1 h失活99.81%，2 h失活99.97%。该对比实验表明，在超大孔海绵体生物炭杀菌技术中硫酸盐亦发挥重要作用。

图  7  柚子皮生物炭体系与无硫酸盐体系及氯盐体系的杀菌效果对照

D为细胞密度。同一组直方柱上方英文小写字母不同表示不同处理组之间细胞密度差异显著(P < 0.05)。

Figure  7.  Bactericidal effect comparison between pomelo peel biochar system, sulfate-free system and chlorine salt system

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为了探明硫酸盐是否可以被其他盐类代替，研究进一步对比了柚子皮生物炭体系与氯盐体系(与硫酸盐等离子强度)的杀菌效果，结果如图 7所示。柚子皮生物炭杀菌体系中，在柚子皮生物炭和50 mmol·L^-1的Na₂SO₄溶液作用下，大肠杆菌快速失活，1 h失活99.81%，2 h失活99.97%，而将硫酸盐替换为氯盐后，在柚子皮生物炭和等离子强度的NaCl溶液作用下，大肠杆菌灭活速率明显变慢，1 h失活75.45%，2 h失活79.11%。由此说明，在超大孔海绵体柚子皮生物炭杀菌技术中硫酸盐的作用是不可替代的。

2.3.4   柚子皮生物炭体系中溶出化学物质的作用

为进一步揭示硫酸盐在超大孔海绵体生物炭杀菌技术中发挥作用的机理，进行柚子皮生物炭杀菌体系与滤液体系杀菌效果的对比，结果如图 8所示。

图  8  柚子皮生物炭体系与滤液体系的杀菌效果对照

D为细胞密度。同一组直方柱上方英文小写字母不同表示不同处理组之间细胞密度差异显著(P < 0.05)。

Figure  8.  Bactericidal effect comparison between pomelo peel biochar system and filtrate system

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可见，虽然与柚子皮生物炭体系的杀菌效果有差距(1 h失活99.81%，2 h失活99.97%)，但柚子皮生物炭和Na₂SO₄溶液混合后的滤液有一定的杀菌作用，1 h失活48.71%，2 h失活71.82%。由此可见，除了柚子皮生物炭的超大孔接触式除菌作用外，柚子皮生物炭和Na₂SO₄溶液混合后可能会溶出具有杀菌作用的化学物质。研究表明，生物质在高温下可生成具有抗菌作用的芳香性酚类或酮类化合物等组分^[19-20]。因此，滤液中的化学物质可能为酚类或酮类化合物，进一步提高了柚子皮生物炭体系的杀菌效果。

3.   结论

研究开发了一种基于超大孔海绵体生物炭的新型杀菌方法，在柚子皮生物炭投加量为4 g·L^-1、硫酸盐浓度为50 mmol·L^-1时即可实现细菌的快速灭活(1 h灭活99.81%，2 h灭活99.97%)，证明此方法具有较好的应用潜力。体系条件对杀毒效果有显著影响，柚子皮生物炭投加量和硫酸盐浓度提高，细菌灭活效率随之提高。柚子皮生物炭的微米级超大孔结构发挥了不可替代的作用，其与细菌尺寸相适配，能较好地捕集细菌或将捕集的细菌接触式灭活。另外，柚子皮生物炭和硫酸盐溶液混合后，可能会溶出具有杀菌作用的芳香性酚类或酮类化合物等化学物质，进一步提高杀菌效果。研究表明，超大孔海绵体生物炭杀毒技术是一种高效的细菌灭活技术，可为农产品产地环境生物污染削减与阻控提供参考方法。