Effects of Single and Combined Pollution of Tetracycline Antibiotics on Physiochemical Properties and Enzyme Activities of Farmland Soil
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摘要:
多数农业用地土壤中抗生素含量在μg·kg-1水平, 而μg·kg-1水平抗生素对土壤质量影响的研究较少, 因此开展0(CK)、10、100和500 μg·kg-1土霉素(OTC)和四环素(TC)的单一及复合污染对土壤理化性质和酶活性的影响研究。结果表明: (1)与CK相比, 两种抗生素单一处理土壤pH均显著增加, 速效磷(OP)含量均显著降低, 且TC处理对pH的增长率和对OP的抑制率均显著高于OTC处理, 仅500 μg·kg-1 TC处理可溶性盐显著降低; 单一OTC处理OP含量显著降低, 有机质(OM)含量增加, 多酚氧化酶(PPO)、脲酶(URE)和蔗糖酶(SUC)活性均显著降低; 单一TC处理OP、OM和有效氮(AN)含量均显著降低, PPO和SUC活性均显著下降。(2)在单一OTC处理中加入低含量TC能在一定程度上缓解OTC对土壤的毒害, 以10 μg·kg-1 TC+10 μg·kg-1 OTC处理综合缓解效果为最佳; 而加入较高含量TC则增大OTC对土壤的毒性, 且毒性随着OTC含量增加呈上升趋势, 以500 μg·kg-1 TC+500 μg·kg-1 OTC处理毒性最大; 各复合处理组PPO活性均被显著抑制, 仅500 μg·kg-1 TC+OTC复合处理URE活性被显著抑制。(3)土壤理化因子与土壤酶活性密切相关, pH是抑制土壤酶活性的关键因子。综上所述, 在μg·kg-1含量水平, 单一抗生素处理TC毒性整体高于OTC; 低、高含量TC与OTC复合处理分别表现为拮抗作用和协同抑制效应。
Abstract:Oxytetracycline (OTC) and tetracycline (TC) are emerging contaminants frequently present at their μg·kg-1 levels in agricultural lands. The effects of μg·kg-1 levels of single and combined pollution of tetracycline antibiotics on soil quality received relatively less attention as yet. In the present study, we spiked 0 (CK), 10, 100 and 500 μg·kg-1 of OTC and TC to farmland soil and tested their single and combined effects in terms of soil physiochemical properties and enzyme activities using pot experiments. Results show that (1) OTC and TC both significantly increased soil pH values and decreased the contents of available phosphorus (OP) compared to the control (CK). Meanwhile, the effects of TC on the growth rate of pH and the inhibition rate of OP were significantly higher than OTCs. Single TC treatment only markedly reduced electrical conductivity (EC) at 500 μg·kg-1; single OTC treatment significantly decreased OP content but increased OM content. In addition, the activities of soil polyphenol oxidase (PPO), urease (URE) and sucrase (SUC) in response to single OTC exposure were significantly lower than the CK. In contrast, single TC treatment significantly decreased the contents of soil OP, OM and available nitrogen (AN), and reduced the activities of PPO and SUC compared to the control. (2) Addition of low concentration of TC to some extent alleviated the toxic effect of OTC on soil quality, and the optimal mitigation effect was observed at the 10 μg·kg-1 TC+10 μg·kg-1 OTC treatment. In contrast, the addition of relatively higher concentrations of TC enhanced the toxic effects of OTC on soil quality, and such effects increased with the increasing of OTC concentrations; and the highest toxicity occurred at the 500 μg·kg-1 TC+500 μg·kg-1 OTC treatment. PPO activity was significantly reduced in all combined treatments compared to the single OTC treatment, but URE activity was only significantly inhibited in the 500 μg·kg-1 TC + OTC treatment. (3) The redundancy analysis showed a close correlation between soil physicochemical factors and soil enzyme activities, and pH value could be the key factor that inhibits soil enzyme activity. In summary, the toxicity of TC is higher than OTC at their respective μg·kg-1 levels. Low TC levels antagonize and high TC synergize the effect of combined TC and OTC treatments, respectively.
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随着集约化养殖业的迅速发展，兽用抗生素得到广泛和大量使用。据统计，我国是世界上最大的抗生素生产国和使用国，兽用抗生素消耗量位居全球之首[1-4]。研究表明，30%~90%的抗生素经动物机体代谢后以原型或代谢产物的形式通过尿液和粪便直接排出体外[4-6]。随着我国有机农业的发展，有机粪肥施用量占施肥总量的61%~88%，即使对畜禽粪便进行相应处理，抗生素去除效率也并不高，且大部分抗生素因在土壤中难以降解而持久地赋存于土壤中[1, 3, 7]，土壤已成为环境中抗生素的重要汇。
研究表明，抗生素对土壤动植物的生理特性、土壤微生物的群落结构和功能等均可造成较大负面影响，并随时间的积累对土壤生态系统的结构和功能产生重要影响[1, 3, 5-11]。土壤理化性质和土壤酶影响着土壤中诸多复杂生物化学进程，可表征土壤肥力状况，是衡量土壤生态环境质量的主要因素，且常与土壤污染物之间存在相关性，可作为评价土壤污染的综合性指标[12-13]。有研究发现，鸡粪中四环素类抗生素〔tetracyclines，TCs，包括四环素(tetracycline，TC)、土霉素(oxytetracycline，OTC)等〕显著降低了土壤有机质、硝态氮、速效磷和速效钾含量，提高土壤pH，土壤脲酶活性明显被抑制，而过氧化氢酶活性无显著变化[14]；猪粪中金霉素(CTC)对土壤速效磷和硝酸盐含量影响不明显，但对铵态氮含量有促进作用[15]。凌德等[16]发现，在1~200 mg·kg-1 OTC暴露条件下，随着OTC含量升高，土壤活性有机碳含量呈递增趋势，土壤脲酶、磷酸酶和转化酶活性均显著下降。JIANG等[17]发现添加50 mg·kg-1 OTC显著抑制土壤脲酶和过氧化氢酶活性。周椿富等[18]发现20 mg·kg-1 OTC在酸、中性土壤中抑制脲酶活性，在碱性土壤中促进脲酶活性。秦俊梅等[19]发现，50 mg·kg-1 TC处理土壤pH以及速效磷、碱解氮、有效钾和有机质含量均显著高于对照，土壤过氧化氢酶、脲酶和蔗糖酶活性均被显著抑制。陈敏杰等[20]却发现10~160 mg·kg-1 OTC和TC处理土壤脲酶、过氧化氢酶和酸性磷酸酶活性总体上呈现“低促高抑”的变化趋势。TCs与重金属复合污染的相关研究表明，强力霉素(doxycycline，DOX)和Cu复合污染对土壤脲酶活性表现为促进作用，对蔗糖酶和过氧化氢酶活性主要为抑制作用[21]，而OTC和Cd复合污染显著抑制土壤脲酶和蔗糖酶活性[22]。除此之外，土壤中抗生素还可通过食物链进入人体，长期累积往往导致人体产生耐药性；同时，环境中抗生素的存在促进了抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes，ARGs)的产生和传播，严重威胁全球公共卫生[23-25]。
目前，我国农用土壤抗生素检出率非常高，检出的抗生素种类众多，但检出含量总体上较低[3, 8, 26-27]。与其他抗生素相比，TCs在土壤中吸附性强、难以降解且存在持久，具有检出率(最高达100%)高、检出浓度变化范围(μg·kg-1~mg·kg-1水平)较大等特点，个别四环素类抗生素检测水平超过国际规定的毒害限量标准(100 μg·kg-1)[3, 5, 24, 26]。调查研究表明，我国长三角地区土壤抗生素残留问题尤为突出，在一些邻近养殖场的菜地或大批量施用禽畜粪便等土壤中检测到TCs含量达到mg·kg-1水平[27]。除了这些特殊场景外，长三角地区多数农田、园地和林地土壤中TCs检测含量在ND~809 μg·kg-1范围，其中，TC和OTC最大检测含量分别为197和530 μg·kg-1[11, 28]。四环素类抗生素在环境中的检测频率、检测含量、空间分布及风险评估已成为研究热点[3, 5, 26-29]。尽管有关TCs对土壤理化性质和土壤酶活性的影响研究较多，但大多针对高含量(mg·kg-1水平)单种抗生素或抗生素与重金属复合污染的生态环境效应。由于多数土壤中抗生素含量处于μg·kg-1水平，且常常同时存在多种抗生素，因此，有必要开展低含量(μg·kg-1水平)抗生素复合污染对土壤生态环境影响的研究。
考虑到TCs在长三角地区非特殊场景土壤实际检测含量，通过室内模拟试验，人为添加TC和OTC研究μg·kg-1含量水平TC和OTC单一及复合污染对农田土壤理化性质和土壤酶活性的影响，以期进一步完善抗生素复合污染土壤生态毒理效应研究，为探讨四环素类抗生素污染土壤生态环境效应和环境风险提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 供试材料
供试土壤采集自安徽省芜湖市南陵县无公害水稻标准化生产基地的农田表层土壤(0~20 cm)，土壤样品于室内自然风干。土壤基本理化性质：pH值为7.61±0.03，有机质含量为(23.57±0.58) g·kg-1，有效氮含量为(0.08±0.03) g·kg-1，经检测，供试土壤无重金属污染，且未检测出抗生素污染。TC和OTC原药(分析纯，纯度大于98%)购于安徽省天根生化科技有限公司。
1.2 试验设计
将风干后的供试土壤分别装入塑料盆(口径23 cm×高度18 cm)中，每盆装土约2.0 kg，以水溶液形式一次性加入不同浓度TC和OTC溶液，并与土壤充分混合，TC和OTC单一和复合处理含量见表 1。以加入同体积蒸馏水土壤作为对照(CK)。各处理均设3个重复，用纤维膜密封。为确保通风，减少水分蒸发，试验期间保持25 ℃和土壤含水率为25%的田间最大持水量恒温恒湿培养条件，处理时间持续40 d[30]。
表 1 TC和OTC处理水平设置Table 1. Setting of TC and OTC treatment level处理 抗生素含量/(μg·kg-1) TC OTC CK 0 0 TC1 10 0 TC2 100 0 TC3 500 0 OTC1 0 10 OTC2 0 100 OTC3 0 500 TC1+OTC1 10 10 TC1+OTC2 10 100 TC1+OTC3 10 500 TC2+OTC1 100 10 TC2+OTC2 100 100 TC2+OTC3 100 500 TC3+OTC1 500 10 TC3+OTC2 500 100 TC3+OTC3 500 500 TC1、TC2和TC3表示TC含量分别为10、100和500 μg·kg-1，OTC1、OTC2和OTC3表示OTC含量分别为10、100和500 μg·kg-1。 1.3 土壤理化性质的测定
40 d后收集土壤，自然风干研磨过2 mm孔径筛，低温保存备用。采用四分法取土样，保存在-20 ℃冰箱中待测。采用常规方法分析测量土壤pH、可溶性盐(electrical conductivity，EC)以及有机质(organic matter，OM)、速效磷(Olsen-P，OP)和有效氮(available nitrogen，AN)含量5个基本土壤理化性质[31-32]。
1.4 土壤酶活性测定分析
土壤蔗糖酶活性、过氧化氢酶活性、脲酶活性和多酚氧化酶活性分别采用3, 5-二硝基水杨酸比色法、碘量滴定法、苯酚-次氯酸钠比色法和邻苯三酚法测定[33-34]。
1.5 数据处理与统计分析
各处理组相关指标数据用平均值±标准误差(mean±SE)表示。采用SPSS 22.0软件单因素方差分析(one-way ANOVA)和LSD多重比较法进行差异显著性检验。采用CANOCO 5.0软件对土壤酶活性-土壤理化因子间关系进行降趋势对应分析(discriminant component analysis，DCA)和冗余分析(redundancy analysis，RDA)。
2. 结果与分析
2.1 四环素和土霉素单一及复合污染对农田土壤基本理化性质的影响
由表 2可知，随着单一TC(TC1~TC3)和单一OTC(OTC1~OTC3)处理水平增加，土壤pH均显著升高(P＜0.05)，平均增长率分别为6.50%和5.05%，而OP含量均显著降低(P＜0.05)，且抑制率随抗生素含量增加而显著上升，平均抑制率分别为24.98%和21.99%。与CK相比，单一OTC处理土壤EC和AN含量均无显著差异(P＞0.05)，OM含量均显著升高(P＜0.05)，且增长率随OTC含量增加呈上升趋势，平均增长率为34.94%；单一TC暴露条件下，与CK相比，仅TC3处理土壤EC显著降低，抑制率为17.31%，TC1~TC2处理无显著差异(P＞0.05)，TC2~TC3处理土壤OM和AN含量均显著降低(P＜0.05)，最高抑制率分别达46.84%和50.00%。
表 2 TC和OTC单一及复合污染对农田土壤理化性质的影响Table 2. Effects of single and combined TC and OTC stress on physico-chemical properties of soil处理 pH 可溶性盐/(mS·cm-1) w(有机质)/(g·kg-1) w(速效磷)/(mg·kg-1) w(有效氮)/(g·kg-1) CK 7.39±0.12a 1.04±0.06a 16.61±0.99a 47.62±1.10a 0.070±0.005a TC1 7.76±0.10b 0.97±0.12a 14.29±0.73a 42.86±0.96b 0.081±0.008a TC2 7.89±0.03c 0.90±0.04a 9.67±0.25d 35.10±0.64c 0.063±0.007c TC3 7.96±0.06e 0.86±0.03b 8.83±0.39d 29.21±0.65d 0.035±0.010d OTC1 7.66±0.11b 1.07±0.02a 20.17±0.93b 40.32±0.68b 0.080±0.007a OTC2 7.85±0.05c 0.96±0.09a 21.01±0.67b 38.10±1.16b 0.071±0.006a OTC3 7.78±0.03d 0.91±0.04a 26.06±0.88c 33.02±0.90c 0.070±0.006a TC1+OTC1 7.76±0.11b 1.10±0.12a 22.70±0.95b 53.02±1.50e 0.095±0.009e TC1+OTC2 7.82±0.08c 1.05±0.05a 20.07±0.98b 49.21±0.82a 0.073±0.007a TC1+OTC3 7.83±0.04c 0.95±0.06a 21.01±0.77b 38.07±0.90b 0.068±0.007a TC2+OTC1 7.89±0.02c 1.06±0.01a 21.01±0.88b 42.54±0.85b 0.049±0.009f TC2+OTC2 7.92±0.02e 0.94±0.05a 17.65±0.83a 39.37±0.64b 0.035±0.005d TC2+OTC3 7.87±0.08c 0.85±0.01b 15.97±0.59a 32.86±0.60c 0.031±0.007d TC3+OTC1 7.91±0.03c 0.95±0.03a 14.29±0.59a 30.32±0.74d 0.037±0.007d TC3+OTC2 7.91±0.03c 0.85±0.06b 16.37±0.58a 29.27±1.03d 0.028±0.008h TC3+OTC3 8.05±0.04e 0.65±0.06d 11.77±0.95e 21.67±0.53f 0.015±0.009g TC1、TC2和TC3表示TC含量分别为10、100和500 μg·kg-1，OTC1、OTC2和OTC3表示OTC含量分别为10、100和500 μg·kg-1。同一列数据后英文小写字母不同表示各处理间某指标差异显著(P＜0.05)。 与单一OTC处理相比，TC1和3种水平OTC复合处理土壤pH和EC含量均无显著变化(P＞0.05)，仅TC1+OTC3处理OM含量较OTC3处理有显著下降(P＜0.05)，但OP和AN含量均呈不同程度提升或维持，其中，TC1+OTC1处理综合提升效果最佳，OM、OP和AN含量较OTC1处理分别显著增加12.54%、36.46%和18.75%。与单一OTC处理相比，TC2、TC3和3种水平OTC复合处理能够不同程度降低土壤EC、OM、OP和AN含量，提升土壤pH，且降幅或增幅均随OTC含量增加而上升，其中，TC3+OTC3处理受抑制程度最大，相较于OTC3处理，pH显著升高3.47%，EC、OM、OP和AN含量分别显著降低28.57%、54.83%、34.37%和78.57%。
综合来看，土壤pH和OP含量对OTC、TC单一及复合污染较为敏感，而EC敏感性最弱。
2.2 四环素和土霉素单一及复合污染对农田土壤酶活性的影响
由表 3可知，与CK相比，OTC、TC单一处理土壤过氧化氢酶(CAT)活性均呈上升趋势，但均未达到显著水平(P＞0.05)。单一OTC(OTC1~OTC3)处理多酚氧化酶(PPO)、脲酶(URE)和蔗糖酶(SUC)活性均显著低于CK(P＜0.05)，抑制率平均分别为46.6%、34.25%和90.42%，其中，URE和SUC活性抑制率均随着OTC含量升高而上升。相较于CK，单一TC(TC1~TC3)处理PPO活性均显著降低(P＜0.05)，抑制率平均为83.72%，但TC1~TC3处理间无显著差异(P＞0.05)；TC1~TC3处理SUC活性也均显著低于CK(P＜0.05)，抑制率平均为86.79%，且高含量的TC3处理显著最低，而TC2与TC1处理间无显著差异(P＞0.05)；仅TC3处理URE活性显著低于CK，抑制率为41.28%，而TC1和TC2处理与CK间均无显著差异(P＞0.05)。
表 3 TC和OTC单一及复合污染对土壤酶活性的影响Table 3. Effects of single and combined TC and OTC stress on soil enzyme activities处理 过氧化氢酶活性/(mg·g-1) 多酚氧化酶活性/(mg·g-1) 蔗糖酶活性/(mg·g-1) 脲酶活性/(mg·g-1) CK 3.07±0.04a 6.02±0.07a 5.88±0.08a 1.09±0.09a TC1 3.09±0.07a 0.98±0.02d 1.18±0.05d 0.97±0.06a TC2 3.10±0.08a 0.98±0.01d 1.01±0.05d 1.05±0.04a TC3 3.10±0.04a 0.98±0.02d 0.14±0.05g 0.64±0.02c OTC1 3.12±0.02a 3.92±0.04b 1.15±0.09d 0.84±0.05b OTC2 3.10±0.03a 2.81±0.02c 0.35±0.10f 0.74±0.01c OTC3 3.10±0.05a 2.94±0.03c 0.19±0.01g 0.57±0.03d TC1+OTC1 3.10±0.09a 0.75±0.04d 4.19±0.16b 0.79±0.01b TC1+OTC2 3.05±0.01a 0.46±0.03e 1.01±0.12d 0.80±0.01b TC1+OTC3 3.00±0.10a 0.42±0.02e 0.73±0.10e 0.77±0.01b TC2+OTC1 3.10±0.09a 0.98±0.05d 1.31±0.15d 0.79±0.02b TC2+OTC2 3.05±0.08a 0.84±0.04d 0.63±0.20e 0.79±0.01b TC2+OTC3 3.01±0.20a 0.84±0.04d 0.71±0.10e 0.81±0.05b TC3+OTC1 3.00±0.10a 0.84±0.04d 2.29±0.04c 0.70±0.02c TC3+OTC2 3.00±0.08a 0.56±0.04e 0.84±0.06e 0.70±0.09c TC3+OTC3 2.50±0.20b 0.84±0.05d 0.05±0.02h 0.42±0.01e TC1、TC2和TC3表示TC含量分别为10、100和500 μg·kg-1，OTC1、OTC2和OTC3表示OTC含量分别为10、100和500 μg·kg-1。同一列数据后英文小写字母不同表示各处理间某指标差异显著(P＜0.05)。 与单一OTC处理相比，TC1、TC2和TC3与3种水平OTC复合处理土壤PPO活性均显著下降(P＜0.05)，平均降幅分别为83.40%、72.18%和76.69%；仅TC3+OTC3处理土壤CAT和SUC活性被显著抑制(P＜0.05)，降幅分别为19.35%和73.68%，其他复合处理CAT活性均无明显变化(P＞0.05)，SUC活性则均不同程度被激活，增幅在13.00%~284.21%。与单一OTC处理相比，TC1和TC2与3种水平OTC复合处理土壤URE活性均不同程度提升或维持，增幅为8.11%~42.11%，但各复合处理组间以及TC1+OTC1和TC2+OTC1处理与OTC1处理间均无显著差异(P＞0.05)；TC3和OTC1~OTC3复合处理URE活性均显著降低(P＜0.05)，降幅为5.41%~26.32%，且TC3+OTC3处理URE活性最低。
综合来看，4种土壤酶对OTC、TC单一及复合污染处理敏感顺序依次为SUC>PPO>URE>CAT。
2.3 农田土壤酶活性与土壤理化因子之间的冗余分析
DCA分析结果中第1轴梯度值(lengths of gradient)小于3，因此选择RDA分析评价土壤酶活性与土壤理化性质(pH、EC、OM、AN和OP)之间相关性。RDA分析结果显示，轴1和轴2累计解释率均达80%以上(表 4)，这说明RDA排序图能很好地解释土壤酶活性与土壤理化性质的相关关系。由图 1可知，pH与4种土壤酶活性之间呈显著负相关；SUC、CAT和URE活性与有效氮、速效磷和电导率间均呈显著正相关，PPO活性与有机质间呈极显著正相关。
表 4 土壤酶活性与土壤理化因子间的RDA分析Table 4. RDA analysis of the relationship between soil enzyme activity and soil physicochemical factors指标 特征值 土壤酶-理化因子相关系数 土壤酶累计变异百分比/% 土壤酶-理化因子累计变异百分比/% 轴1 0.644 0.931 64.39 85.60 轴2 0.106 0.653 74.94 99.63 轴3 0.002 0.555 75.15 99.91 轴4 0.001 0.453 75.22 100.00 ![]()
图 1 土壤酶活性与土壤理化因子间的冗余分析PPO为多酚氧化酶，CAT为过氧化氢酶，URE为脲酶，SUC为蔗糖酶，EC为可溶性盐，OM为有机质，AN为有效氮，OP为速效磷。Figure 1. Redundancy analysis between soil enzyme activities and soil physicochemical factors3. 讨论
3.1 土霉素和四环素单一及复合污染对土壤理化性质的影响
四环素类抗生素分子中均含有较多的易电离官能团羧基(—COOH)，多种机理共同作用使其具有较强被吸附能力，与土壤亲和力强，不易降解[5, 8, 20, 35]。四环素类抗生素被吸附在土壤中后，自身可以作为碳源增加微生物活性，同时它还可以通过影响土壤微生物活性、多样性、群落结构和功能等，直接或间接改变土壤理化性质和土壤酶活性[18, 20, 35-37]。
笔者研究中OTC、TC单一及复合处理土壤pH均显著高于CK，土壤呈碱化趋势，这与秦俊梅等[19]和于晓雯等[14]研究结果一致，其可能原因是四环素类抗生素抑制或杀死一些土壤微生物，尤其可能抑制酸杆菌门细菌活性，使其无法正常分泌有机酸，从而使土壤pH值升高[14, 35-36]。但韩旭[38]研究发现，单施磺胺甲恶唑(SMZ)对土壤pH影响不显著，笔者研究结果与之有差异，这也说明不同类型和含量抗生素对土壤pH的影响作用存在差异，抗生素胁迫条件下土壤pH变化机制尚有待深入研究。笔者发现各抗生素处理土壤OP含量均显著低于CK，这与于晓雯等[14]发现鸡粪中TCs能显著降低土壤OP含量的结果一致，而与秦俊梅等[19]发现TC处理和STONE等[15]发现CTC处理对OP含量影响均不显著的结果存在差异；单一OTC处理显著促进土壤OM含量升高，对AN含量无明显作用，这与凌德等[16]研究结果基本一致，而单一TC处理却显著抑制OM和AN含量，这与于晓雯等[14]研究结果基本一致，但与秦俊梅等[19]发现TC处理显著促进OM和AN含量的研究结果存在差异。上述研究结果间的差异可能与抗生素类型及供试抗生素含量有关，也可能与试验选用的土壤类型和土壤微生物群落差异较大有关，四环素类抗生素在不同土壤中赋存特性和反应存在一定差异，从而对土壤养分的表现作用也不同[39]。
此外，笔者研究发现，单一TC处理对pH的平均增长率和对OP含量的平均抑制率均显著高于单一OTC处理，结合OM和AN含量变化情况来看，整体上，TC处理对土壤理化性质的抑制作用高于OTC处理，这反映TC暴露对土壤生态环境的毒性高于OTC，其可能原因与这两种抗生素在土壤中的半衰期和降解速率差异有关。有报道发现鸡粪中OTC和TC在棕壤中的半衰期分别为26.80和63.24 d[40]，且早期OTC降解速率要高于TC[41]，而笔者研究培养时间为40 d，导致试供土壤中OTC降解程度可能高于TC，使得TC在土壤中滞留时间更长，对土壤微生物的毒害效应更久，从而造成TC毒性强于OTC。
目前有关重金属-抗生素复合污染对土壤生态环境影响的研究较多，其主要原因可能与重金属与抗生素发生络合反应有关[21-22]，而有关不同种类抗生素复合污染生态效应的研究相对较少。笔者研究发现，相比单一OTC处理，10 μg·kg-1 TC与3种水平OTC复合处理能不同程度提升土壤OP、AN和OM含量，其中，TC1+OTC1处理综合提升效果最佳，说明低含量TC与OTC复合处理对土壤理化性质表现出较为明显的拮抗作用。究其原因，一方面可能是由于低含量TC与OTC对土壤微生物存在竞争吸附，促进土壤微生物代谢多样性[21, 42]；另一方面，10 μg·kg-1抗生素远低于毒害限量标准(100 μg·kg-1)，土壤微生物易适应添加低含量抗生素土壤环境，低含量抗生素可能转变为微生物碳源，反而促进微生物活性，同时微生物可能会加快抗生素降解，从而降低抗生素毒害作用[22, 43]。笔者研究中，TC2和TC3与3种水平OTC复合处理均不同程度增强单一抗生素处理对土壤生态系统的毒害作用，且这种毒害效应随着OTC水平增加呈上升趋势，TC3+OTC3处理综合抑制程度达到最大，土壤pH均显著高于以及EC、OM、OP和AN含量均显著低于相应单一OTC处理组，这说明高含量TC和OTC复合暴露对土壤理化性质整体上表现出协同作用。阮琳琳等[42]研究发现，10~20 mg·kg-1磺胺二甲嘧啶(SM2)和强力霉素(DOX)共存时短期内会抑制彼此降解。笔者研究中可能也存在类似现象，当高含量TC和OTC共存时可能降低彼此降解，因此经过40 d处理后，高起始浓度的两种抗生素复合处理的残留含量可能高于对应浓度的单一抗生素处理的残留含量，导致高含量复合抗生素处理土壤微生物受毒害作用更加显著，从而加剧土壤理化性质被抑制程度。
3.2 土霉素和四环素单一及复合污染对土壤酶活性的影响
土壤酶参与土壤中各种复杂生物学和生物化学反应，可表征土壤肥力和土壤自净能力。有研究[37, 43-44]表明，土壤酶活性受抗生素类型、含量和暴露时间的共同影响。过氧化氢酶(CAT)属于氧化还原酶，它的活性反映土壤呼吸作用和微生物生命活动的强弱[43]。笔者研究中，OTC和TC单一及复合处理(除TC3+OTC3处理外)土壤CAT活性与CK间均无显著差异，这与陈敏杰等[20]对1 000 μg·kg-1 TC处理，张文婕等[43]对0.05~0.2 mmol·kg-1 OTC处理，以及于晓雯等[14]对500 μg·kg-1四环素类混合添加处理的结果均一致，但与JIANG等[17]和秦俊梅等[19]对50 mg·kg-1 OTC和TC处理土壤CAT活性显著降低的结果有所不同。研究结果间的差异一方面可能与供试抗生素含量不同有关，土壤微生物对低含量抗生素会产生忍耐力和适应性，导致低含量抗生素对土壤CAT活性影响不显著，而高含量抗生素处理显著抑制土壤CAT活性；另一方面可能是由于四环素类抗生素生物化学氧化反应产生大量过氧化氢，土壤中需氧生物为了防止被过氧化而需要提高CAT活性来解除过氧化氢毒害，使得土壤CAT活性能持续升高或维持一定水平[45]。
多酚氧化酶(PPO)是土壤中重要的氧化还原酶，能够参与芳香族类化合物的分解转化过程，并可促进木质素和酚类化合物的分解，而后形成类腐殖质的大分子化合物[46-47]。笔者研究中，OTC和TC单一和复合处理PPO活性均显著降低，这与林琳等[46]研究结果基本一致。PPO活性降低可能是由于其参与分解转化土壤中TCs。此外，笔者研究发现两种TCs单一处理土壤PPO活性均显著低于CK，而此时土壤OM含量也显著低于CK。同时，RDA分析结果表明PPO活性与土壤OM呈显著正相关，这说明两种TCs处理可能抑制微生物活性，导致土壤PPO活性显著减弱，从而降低土壤OM含量。土壤蔗糖酶(SUC，转化酶)的酶促作用产物与土壤中营养元素(如OM、N和P)含量、微生物数量及土壤呼吸强度密切相关，对于增加土壤中易溶解营养物质起重要作用，在与SUC活性呈显著相关的土壤理化性质(如OM、OP含量等)中，OP含量不仅与SUC活性呈极显著正相关且相关系数最大[37]。笔者研究中，OTC和TC单一及复合处理SUC活性均显著低于CK，这与秦俊梅等[19]研究结果一致，这可能是因为一方面TCs抑制土壤微生物代谢活性，导致SUC活性下降；另一方面TC可能进入蔗糖酶分子中，与酶分子结合形成稳定络合物，酶活性降低，从而表现出对SUC活性的抑制作用。此外，笔者研究中土壤理化因子与土壤酶活性的RDA分析结果也表明OP含量与SUC活性呈显著正相关，与相关研究结果[37]一致。脲酶(URE)是一种酞胺水解酶，在土壤中主要来自于植物和微生物，其在氮肥利用和土壤氮素代谢方面有重要意义[33]。OTC和TC单一和复合处理土壤URE活性低于或者显著低于CK，这与相关文献报道[14, 16-17, 19, 45]较为相似。这可能是由于TCs进入土壤后与土壤酶分子中活性部位(如巯基和含咪唑的配位体)结合形成较稳定的络合物，抑制酶的活性中心，从而降低酶活性。
需要说明的是，笔者研究中OTC和TC复合处理对土壤酶活性的影响不同于对土壤理化性质的作用。OTC和TC复合处理对土壤酶活性的影响机制较为复杂，在低含量复合处理时整体表现为拮抗作用(TC1+OTC1处理拮抗作用尤为突出)，在高含量复合处理时整体表现为协同抑制作用(TC3+OTC3处理组协同作用尤为突出)。相比于单一OTC处理，仅TC3+OTC3处理土壤CAT和SUC活性显著降低，其他复合处理酶活性均不同程度被激活，尤其以SUC活性上升最为显著，此时OTC与TC之间表现为拮抗作用，这与闫雷等[22]研究结果相类似；TC1、TC2与OTC2、OTC3复合处理土壤URE活性均显著升高，两者之间表现为拮抗作用；而TC3与OTC1~OTC3复合处理土壤URE活性均明显被抑制，TC3+OTC3处理显著最低，两者之间表现为协同抑制作用；各复合处理PPO活性均显著降低，两者之间表现为协同抑制作用。这说明四环素类抗生素复合污染对土壤酶活性的影响与土壤酶类型和抗生素含量有关。由于TCs具有酰胺键结构，而URE以酰胺键为底物，根据底物诱导原理，TCs对URE的激活效应大于抑制效应，但高含量TCs更易于与URE分子形成结合位点而抑制酶活性[22, 48]，因此高含量TC与OTC复合处理更有利于抗生素与URE结合，形成低活性的稳定络合物，从而抑制URE活性。
4. 结论
(1) 单一抗生素污染条件下，TC毒性总体上高于OTC。
(2) 复合污染条件下，低含量(10 μg·kg-1)TC可以在一定程度上缓解单一OTC污染对土壤生态系统的毒害作用，以TC1+OTC1处理(10 μg·kg-1 TC+10 μg·kg-1 OTC)综合缓解效果为最佳。较高含量TC会增强OTC对土壤生态系统的毒害作用，且随着OTC水平增加呈上升趋势，以TC3+OTC3处理(500 μg·kg-1 TC+500 μg·kg-1 OTC)受抑制程度为最大。
(3) 低含量TC与OTC复合污染整体表现为拮抗作用，而高含量TC与OTC产生协同抑制作用。
(4) 土壤pH与4种土壤酶活性均呈显著负相关，是抑制土壤酶活性的重要环境因子。
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图 1 土壤酶活性与土壤理化因子间的冗余分析
PPO为多酚氧化酶，CAT为过氧化氢酶，URE为脲酶，SUC为蔗糖酶，EC为可溶性盐，OM为有机质，AN为有效氮，OP为速效磷。
Figure 1. Redundancy analysis between soil enzyme activities and soil physicochemical factors
表 1 TC和OTC处理水平设置
Table 1 Setting of TC and OTC treatment level
处理 抗生素含量/(μg·kg-1) TC OTC CK 0 0 TC1 10 0 TC2 100 0 TC3 500 0 OTC1 0 10 OTC2 0 100 OTC3 0 500 TC1+OTC1 10 10 TC1+OTC2 10 100 TC1+OTC3 10 500 TC2+OTC1 100 10 TC2+OTC2 100 100 TC2+OTC3 100 500 TC3+OTC1 500 10 TC3+OTC2 500 100 TC3+OTC3 500 500 TC1、TC2和TC3表示TC含量分别为10、100和500 μg·kg-1，OTC1、OTC2和OTC3表示OTC含量分别为10、100和500 μg·kg-1。 
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表 2 TC和OTC单一及复合污染对农田土壤理化性质的影响
Table 2 Effects of single and combined TC and OTC stress on physico-chemical properties of soil
处理 pH 可溶性盐/(mS·cm-1) w(有机质)/(g·kg-1) w(速效磷)/(mg·kg-1) w(有效氮)/(g·kg-1) CK 7.39±0.12a 1.04±0.06a 16.61±0.99a 47.62±1.10a 0.070±0.005a TC1 7.76±0.10b 0.97±0.12a 14.29±0.73a 42.86±0.96b 0.081±0.008a TC2 7.89±0.03c 0.90±0.04a 9.67±0.25d 35.10±0.64c 0.063±0.007c TC3 7.96±0.06e 0.86±0.03b 8.83±0.39d 29.21±0.65d 0.035±0.010d OTC1 7.66±0.11b 1.07±0.02a 20.17±0.93b 40.32±0.68b 0.080±0.007a OTC2 7.85±0.05c 0.96±0.09a 21.01±0.67b 38.10±1.16b 0.071±0.006a OTC3 7.78±0.03d 0.91±0.04a 26.06±0.88c 33.02±0.90c 0.070±0.006a TC1+OTC1 7.76±0.11b 1.10±0.12a 22.70±0.95b 53.02±1.50e 0.095±0.009e TC1+OTC2 7.82±0.08c 1.05±0.05a 20.07±0.98b 49.21±0.82a 0.073±0.007a TC1+OTC3 7.83±0.04c 0.95±0.06a 21.01±0.77b 38.07±0.90b 0.068±0.007a TC2+OTC1 7.89±0.02c 1.06±0.01a 21.01±0.88b 42.54±0.85b 0.049±0.009f TC2+OTC2 7.92±0.02e 0.94±0.05a 17.65±0.83a 39.37±0.64b 0.035±0.005d TC2+OTC3 7.87±0.08c 0.85±0.01b 15.97±0.59a 32.86±0.60c 0.031±0.007d TC3+OTC1 7.91±0.03c 0.95±0.03a 14.29±0.59a 30.32±0.74d 0.037±0.007d TC3+OTC2 7.91±0.03c 0.85±0.06b 16.37±0.58a 29.27±1.03d 0.028±0.008h TC3+OTC3 8.05±0.04e 0.65±0.06d 11.77±0.95e 21.67±0.53f 0.015±0.009g TC1、TC2和TC3表示TC含量分别为10、100和500 μg·kg-1，OTC1、OTC2和OTC3表示OTC含量分别为10、100和500 μg·kg-1。同一列数据后英文小写字母不同表示各处理间某指标差异显著(P＜0.05)。
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表 3 TC和OTC单一及复合污染对土壤酶活性的影响
Table 3 Effects of single and combined TC and OTC stress on soil enzyme activities
处理 过氧化氢酶活性/(mg·g-1) 多酚氧化酶活性/(mg·g-1) 蔗糖酶活性/(mg·g-1) 脲酶活性/(mg·g-1) CK 3.07±0.04a 6.02±0.07a 5.88±0.08a 1.09±0.09a TC1 3.09±0.07a 0.98±0.02d 1.18±0.05d 0.97±0.06a TC2 3.10±0.08a 0.98±0.01d 1.01±0.05d 1.05±0.04a TC3 3.10±0.04a 0.98±0.02d 0.14±0.05g 0.64±0.02c OTC1 3.12±0.02a 3.92±0.04b 1.15±0.09d 0.84±0.05b OTC2 3.10±0.03a 2.81±0.02c 0.35±0.10f 0.74±0.01c OTC3 3.10±0.05a 2.94±0.03c 0.19±0.01g 0.57±0.03d TC1+OTC1 3.10±0.09a 0.75±0.04d 4.19±0.16b 0.79±0.01b TC1+OTC2 3.05±0.01a 0.46±0.03e 1.01±0.12d 0.80±0.01b TC1+OTC3 3.00±0.10a 0.42±0.02e 0.73±0.10e 0.77±0.01b TC2+OTC1 3.10±0.09a 0.98±0.05d 1.31±0.15d 0.79±0.02b TC2+OTC2 3.05±0.08a 0.84±0.04d 0.63±0.20e 0.79±0.01b TC2+OTC3 3.01±0.20a 0.84±0.04d 0.71±0.10e 0.81±0.05b TC3+OTC1 3.00±0.10a 0.84±0.04d 2.29±0.04c 0.70±0.02c TC3+OTC2 3.00±0.08a 0.56±0.04e 0.84±0.06e 0.70±0.09c TC3+OTC3 2.50±0.20b 0.84±0.05d 0.05±0.02h 0.42±0.01e TC1、TC2和TC3表示TC含量分别为10、100和500 μg·kg-1，OTC1、OTC2和OTC3表示OTC含量分别为10、100和500 μg·kg-1。同一列数据后英文小写字母不同表示各处理间某指标差异显著(P＜0.05)。
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表 4 土壤酶活性与土壤理化因子间的RDA分析
Table 4 RDA analysis of the relationship between soil enzyme activity and soil physicochemical factors
指标 特征值 土壤酶-理化因子相关系数 土壤酶累计变异百分比/% 土壤酶-理化因子累计变异百分比/% 轴1 0.644 0.931 64.39 85.60 轴2 0.106 0.653 74.94 99.63 轴3 0.002 0.555 75.15 99.91 轴4 0.001 0.453 75.22 100.00
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